卵巢疾病的遗传学基础

2．分子水平（1）基因克隆基因克隆是将包含目的基因的外源性dna与dna载体相连接，然后导入合适的细菌细胞中。外源性dna随着载体在细菌细胞内繁殖而不断复制，然后可将这些扩增的基因分离、纯化以供研究之用。常用的载体至少有四类①质粒。②细菌噬菌体。③粘性质粒。④酵母菌人工染色体。（2）多聚酶链反应（pcr）多聚酶链反应是一种通过dna多聚酶作用在体外迅速合成dna序列的方法。利用一对人工合成的寡聚核苷酸引物，在热循环仪中合适的反应条件和dna多聚酶的催化下，通过与模板dna相互作用，即变性、退火、延长等过程的反复，使目的dna得以数十万倍计地扩增，进一步用于dna鉴定和序列测定等多方面的研究。（3）基因探针检测以基因探针探测未知标本的方法很多，无论用那一种方法，均可采用聚合酶链反应使dna片段拷贝数扩增几十万倍以上，可以使基因诊断更省标本，更易成功。1）southern印记法dna片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上，然后转移到硝酸纤维素膜等支持膜上进行预杂交和杂交。此分析法分两种，一种是直接分析法由于基因缺失或突变，当备测dna经限制性内切酶消化后所产生的dna片段与正常dna片段长度不同，探针杂交后可探测出dna酶解片段长度上的差异。另一种是间接分析法对某些基因的变化目前尚未找出特异的限制性内切酶将正常基因与突变基因区别开来，因此，采用限制性dna片段长度多态性分析，通过突变基因与特定的多态性片段紧密连锁而被发现。〖5〗〖6〗〖7〗2）斑点杂交此方法的原理和southem印记法相同。只是dna样品量少，把样品变性处理后直接吸附在硝酸纤维素膜上进行杂交。3）northern印记法此法用探针与rna进行杂交，反映基因产物的过度表达。也就是先提取rna，用乙二醛或甲醛变性处理，然后凝胶电泳分离，再转移至支持膜上进行杂交。4）人工合成探针直接探测法合成的探针是一种寡聚核苷酸。探测某一突变点时需要合成两种探针，一种与正常基因片段序列一致，另一种与突变基因片段序列一致。（4）dna序列测定dna序列测定的基本方法有两种。一种使dna的化学降解法，另一种使dna合成法。两种方法都有一系列dna分子生成，这些dna分子的长度只差一个碱基，可经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，在凝胶上形成带梯。在典型的序列实验中同时进行4个不同碱基的反应，反应产物置同一块凝胶上分4行电泳，然后进行放射自显影。相应于某一长度的放射性显带只出现于其中一行电泳中，因此，根据各条带在各行电泳中的位置可确定存在于dna分子中相应位置的核苷酸。这样，dna序列就被读为依次由一条带到下一条带的碱基顺序。测定基因中核苷酸序列对于了解基因结构、功能和基因突变具有极其重要的意义。（5）转基因动物利用转基因动物可以研究人体基因在活体的调节和表达。在体外将目的基因注入动物的受精卵，然后将载有外源性目的基因的受精卵移植到动物体内。在由此繁衍形成的后代中，可以研究外源性基因在个体中的表达以及结构和功能的改变。〖5〗〖6〗〖7〗