赤芍、甘草等中药合剂治急性荨麻疹机理的实验研究

摘要目的赤芍、甘草等中药合剂（简称抗敏口服液）治疗急性荨麻疹的机理。方法①动物实验肥大细胞脱颗粒实验，被动皮肤过敏实验。②实验室检测双抗体夹心elisa法检测急性荨麻疹患者治疗前后il－2、il－4水平。结果抗敏口服液组肥大细胞脱颗粒百分数及吸光度值明显低于其它各组药物（p＜0.01），抗敏口服液可使急性荨麻疹患者体内升高的il－4及降低的il－2恢复到正常。结论抗敏口服液可稳定肥大细胞膜、抑制抗原抗体结合、调整il－2和il－4浓度，对急性荨麻疹有较好的治疗效果。therapeuticmechanismofachinesemedicinedecoctionforurticariasongdongyan，chendeyu，xiongxia.（departmentofdermatology,affiliatedhospital,zhenjiiangmedicalcollege,jiangsu212001）abstractobjectivetoinvestigatetherapeuticmechanismofachinesemedicinedecoctionforurticaria.methodsmastocytedegranulationtestandpassiveskinallergytestwereconductedinanimalmodel.asandwichelisatechniquewasappliedtodetectserumil－2andil－4inpatientswithacuteurticariabeforeandafteroraladministrationofthedecoction.resultssignificantinhibitionofmastocytedegranulationwasfoundinmicetakenthedecoctionincomparisonwithcontrols.thereweresignificantlyincreasedlevelofil－2andreducedlevelofil－4inseraofpatientswithacuteurticaria.serumlevelsofil－2andil－4recoveredtonormalinpatientsaftertakingthedecoction.conclusionthechinesemedicinedecoctionappearstostabilizethemembraneofmastocytesandinhibitantigen－antibodybinding.thedecoctionisalsolikelytoadjustserumlevelsofil－2andil－4tonormal.keywordspharmacotherapy,tcdurticariainterleukin－2interleukin－4我们在临床上用赤芍、甘草等中药合剂（简称抗敏口服液）治疗急性荨麻疹患者，取得了较好疗效，为进一步研究其治疗机理，我们作了一系列动物实验和临床试验，现将结果报道如下。材料和方法（一）实验材料抗敏口服液由四川泰华制药有限公司提供，批号980901。由赤芍、甘草等中药组成。赤芍、地龙、甘草、赤芍＋甘草、赤芍＋甘草＋地龙各100ml，相当于生药220g，由泸州医学院药剂科提供。实验动物wistar大白鼠150只，雌雄各半，体重（200±。20）g，一级标准，四川省医学实验动物合格证编号医动字24101116，泸州医学院动物饲养科提供。实验期间全部动物饲以标准颗粒饲料，饮用自来水。临床试验对象急性荨麻疹患者为1998年10月至1999年3月我科住院患者，其中患者组20例，男8例，女12例，年龄12～72岁，平均年龄岁，病期1～6d，平均2.6d，所有患者在采样前3d均停止或不用抗组胺药及免疫抑制剂，采样前1周未用过皮质类固醇等。正常人对照组20例，均为体检正常人，性别与治疗组相同，年龄相差不超过3岁。实验试剂及仪器设备hanks液，ph为7.2，edta的质量浓度为0.5g/l，天花粉为致敏原，溶剂为市售质量分数为4％～5％氢氧化铝凝胶，临时用5mg天花粉溶于1ml氢氧化铝凝胶溶解。l2t2台式电动离心机，tg328a型光学读取分析天平（清华天平仪器厂生产）。t21型分光光度计（四川分析仪器厂产）。（二）实验方法1.肥大细胞脱颗粒实验取上述未用药大白鼠6只，断头取血并收集血清。随机将大白鼠分为抗敏组、赤芍组、地龙组、甘草组、赤芍＋甘草组、赤芍＋甘草＋地龙组、空白组。每组10只，按5ml/kg，每日1次于晨8时灌胃，分别于第6、7、8、9、10天每组各取2只，腹腔按10ml/kg注射上述天花粉氢氧化铝凝胶，20min后，右腹腔内注射上述hanks液（注射前加热）15～20ml，轻揉腹部2min后，脱颈椎处死大鼠，打开腹腔，用毛细吸管收集腹腔液（富含肥大细胞）于离心管中，2000r/min离心15min，弃上清液用含大白鼠血清的hanks液洗涤1次，离心弃上清液，加入含25％大白鼠血清的hanks液洗涤1次，离心弃上清液，加入含25％大白鼠血清的hanks液1ml混匀，制成肥大细胞悬液观察。取制备的肥大细胞悬液1滴于载玻片上，盖上涂有中性红染液的盖片，在高倍显微镜下观察，正常肥大细胞为正圆形，边缘整齐。脱颗粒的肥大细胞边缘不整齐或细胞破裂，有颗粒自细胞浆溢出，随机计数100个细胞，计数脱颗粒细胞数及脱颗粒百分数。电镜观察，取大白鼠的小肠系膜，用2.5％戊二醛预固定2h，磷酸盐缓冲液漂洗3次，1％四氧化二锇固定1h，丙酮梯度脱水。epon－618环氧树脂包埋，超薄切片机切片，jeol－10esx透射电镜观察，加速电压80kv，放大倍数8000倍。2.被动皮肤过敏反应试验抗血清的制备取4只未用药（200±。30）g大白鼠，将上述天花粉氢氧化铝凝胶混悬液脚掌注射，每个脚掌注射0.1ml，每只大白鼠0.4ml，15d后，断头取血离心得抗血清。将上述取得的抗血清稀释10倍。另取上述用药各组大白鼠8只，剪去背部的毛，选2点，每点皮内注射上述抗血清0.1ml，48h后进行抗原攻击，尾静脉注射天花粉10mg/kg，天花粉用1％伊文思蓝溶液配成1mg/kg。20min后断头处死动物，翻转背部皮肤，将蓝色反应斑皮片剪下，剪碎加入丙酮－生理盐水（7∶3）混合溶液6ml浸泡，次日过滤并离心，在波长610nm处测吸光度a值。3.实验室检测急性荨麻疹患者口服抗敏口服液10ml，日3次，共治疗7d。于治疗前后各取患者血清，采用双抗体夹心elisa法检测il－2及il－4，elisa药盒购自深圳晶美生物有限公司。首先分别将标准品il－2稀释为1000、500、250、125、62.5、0pg/ml，il－4稀释为375、187.5、93.75、46.88、23.44、0pg/ml，分别将稀释后的标准品及标本加入已用抗体il－2，il－4单抗预包被的聚苯乙烯反应小孔内，每孔100μl，用封板胶纸封住反应孔，37℃，90min，用pbs洗5次，每孔加生物素标记二抗100μl，封住板孔，37℃，60min。pbs洗板5次，再加稀释好的酶联物100μl，封住板孔，37℃，30min。pbs洗板5次，每孔加底物a、b各50μl，或1滴，避光37℃，15min。每孔加终止液50μl或1滴混匀，即刻用bio－rad公司生产的酶标仪在波长450nm处测其吸光度a值，用直线回归分析，求出其标准方程，计算待检血清中il－2、il－4的含量，单位为pg/ml。结果一、肥大细胞脱颗粒实验1.各组肥大细胞脱颗粒百分数从表1可见，抗敏组的肥大细胞脱颗粒百分数与其它各组相比最小，空白组与其它各组相比最大，其它各组也较高，各组与抗敏组比较，差异均有显著性（p＜0.01），说明抗敏口服液可以有效抑制肥大细胞脱颗粒。2.被动皮肤过敏实验抗敏组的a值最小为0.08±。0.04，显著低于赤芍组（0.32±。0.09）、地龙组（0.21±。0.14）、甘草组（0.25±。0.16）、赤芍＋甘草组（0.24±。0.02）、赤芍＋甘草＋地龙组（0.28±。0.08）及空白组（0.48±。0.06）,经t检验，p均＜0.01。二、临床试验检测结果见表2。治疗前，荨麻疹患者与健康人比较il－2明显降低，il－4明显升高，p均＜0.01。经抗敏口服液治疗后荨麻疹患者il－2、il－4趋于正常，与正常人比较，p＞0.05。治疗前后比较，差异均有显著性（p＜0.05）。表1药物对肥大细胞脱颗粒数的影响组别喂药天数q值p值6d7d8d9d10d抗每组2219141111赤芍组80887170723.67＜0.01地龙组86838079724.55＜0.01甘草组76747176713.93＜0.01赤芍+甘草组72707070673.11＜0.01赤芍+甘草+地龙组51545950361.04＜0.01空白组88759191935.43＜0.01表2急性荨麻疹患者用抗敏2口服液治疗前后il-2、il-4水平比较例数il-2il-4急性荨麻诊组20治疗前173.3±。49.798.8±。13.0治疗后519±。14.232.7±。8.9正常人20520±。14934.3±。8.6讨论从肥大细胞实验中，我们可以发现抗敏口服液对肥大细胞脱颗粒有明显的抑制作用。被动皮肤过敏反应实验提示，抗敏口服液无论与其拆方或空白组相比，其对抗原抗体的结合都有明显抑制作用。因此，其具有明显的抗ⅰ型变态反应的作用，并且随着时间的延长，作用加强。实验室检测方面检测结果发现荨麻疹患者il－4含量显著高于正常对照组，经抗敏口服液治疗后il－4含量明显下降，而与正常人组比较，差异无显著性，说明抗敏口服液可能是通过降低il－4来治疗荨麻疹患者。il－2系t淋巴细胞活化过程中由细胞膜所分泌的一种糖蛋白，具有促进t细胞、b细胞、nk细胞增生、分化、增强效应，细胞活化，诱导干扰素产生及免疫调节等多种功能。同时也是t细胞活化标志之一。bensasson等认为t淋巴细胞产生il－4需要il－2，il－2可上调il－4诱导ige合成。但相反的报道〖2〗认为il－2能抑制正常人和过敏患者外周血单一核细胞，由il－4诱导ige合成。我们的研究表明荨麻疹患者发作期血清il－2水平显著低于正常人对照组（p＜0.01）。荨麻疹患者由于il－2水平下降，使il－2对il－4促进b细胞合成ige的抑制作用被减弱，使ige合成增强。经抗敏口服液治疗后荨麻疹患者il－2趋于正常，治疗前后比较，差异有显著性，治疗后与正常人比较差异无显著性（p＞0.05），说明抗敏口服液的治疗机理之一是升高il－2。这也解释了临床上服抗敏口服液患者一般情况改善，抵抗力增加的问题。我们在临床上应用抗敏口服液治疗急性荨麻疹，取得了较好疗效。为进一步探讨其治疗机理，我们做了细胞因子的实验。通过以上分析，我们可以得知，抗敏口服液可以通过调整细胞因子来治疗荨麻疹，这为治疗过敏性疾病提供了一条有效的途径。