酶联免疫吸附试验

【原理】

本法用带正电荷的聚氯乙烯（pvc）微量反应板，将精子抗原吸附到聚氯乙烯固相载体表面，其固相抗原可与待测标本中抗精子抗体（as-ab）结合，并与加入的抗人igg酶结合物起反应，形成抗原抗体酶结合物，最终在酶底物作用下而显色。

【试剂】

（1）包被液：0.01mol/lph9、6碳酸钠缓冲液：

na2co31、06g

nahco30.84g}加双蒸水至1000ml。

（2）缓冲液：0.01mol/lph7、4pbs：

【方法】

（1）精子抗原制备：筛选收集精液常规检查正常的精液，用生理盐水反复离心洗涤，尽可能除去精浆，经超声波超声粉碎，10～15min高速离心，吸上清，测定上清液蛋白浓度，将蛋白浓度稀释为3、5～5、0μg/ml，为精子抗原溶液。

（2）反应板包被抗原：将人精子抗原稀释成3、5～5μg/ml，包被液加到聚氯乙烯微量测定板内，每孔100μl，置4℃冰箱过夜。

（3）封闭处理：次日早晨，倾去抗原溶液，用洗涤pbs洗3次，每次5min，每次洗涤后都要将板在纸上拍干，再加入1%的聚乙烯醇溶液200μl封闭，置室温1h后同上法洗涤。

（4）加待测样品：样品用pbs稀释100倍，每孔加入100μl，同时加as-ab血清及正常处女血清作分别阳性和阴性对照，置37℃温育1h，同上法洗涤。

（5）加酶结合物：hrp-proteina以1∶640稀释，每孔加入100μl，置室温1h，同上洗涤。

（6）酶反应：加新鲜配制的opd底物溶液，每孔加入50μl，置室温暗处10min，再加10%h2so4终止液每孔50μl。

（7）结果判定：用酶标测定仪490μm测其od值，od值≥2、0时为阳性。